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En la entrada anterior (Mi Proyecto I) me quedé en los primeros resultados obtenidos con células HaCaT, las cuales no llegaban a diferenciarse completamente.

Tras estos resultados, se optó por empezar experimentos con Keratinocitos primarios. Los primeros resultados no fueron nada alentadores: morían todas las células sembradas sobre el gel de colágeno. Se empezó a modificar la composición del medio de cultivo y tras varios intentos (muchos meses de trabajo) finalmente se dio con algo que funcionaba. Al ver el cultivo organotípico al microscopio se vio esto:

Muy cerca

Por fin algo que se acercaba a piel. Las capas basales de la epidermis son un tanto irregulares, pero lo que importa es que los keratinocitos se diferencian y acumulan keratina. Las tres bandas típicas de la foto de libro de texto de la piel al menos se pueden intuir. La siguiente pregunta a hacerse ahora era: ¿Es sólo la estructura lo que se parece o también se parece la función?

Inmunofluorescencia

Para contestar esa pregunta se realizaron diversas inmunofluorescencias sobre cortes de piel normal y cortes de cultivos organotípicos. La Inmunofluorescencia es una técnica de biología molecular que consiste en incubar una muestra con un anticuerpo que detecte la molécula o componente que queramos detectar. Dicho anticuerpo lleva unida una molécula fluorescente (inmunofluorescecnia directa) o bien es reconocido por un segundo anticuerpo marcado fluorescentemente (inmunfluorescencia indirecta).

Las moléculas fluorescentes tienen la particularidad de que emiten luz de una determinada longitud de onda al ser excitadas con luz de otra determinada longitud de onda.

En las siguientes microfotografías se ha utilizado un anticuerpo para detectar la molécula que nos interesaba y luego un anticuerpo secundario que reconoce al primero (técnica indirecta) que estaba unido a “Alexa 488″, una molécula fluorescente que emite luz verde al ser estimulada con luz de una longitud de onda de 488nm. Se ha utilizado también DAPI, una molécula fluorescente que emite en la región del azul cuando está unida a DNA, de forma que nos permite ver la localización de los núcleos de las células.

Resultados

Aquí podemos ver un corte de piel normal incubado con un anticuerpo anti-keratina 14. La keratina 14 es una de las (muchas) variedades de keratina y su particularidad es que se expresa en las capas basales de la epidermis.

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En la imágen superior vemos la misma tinción de keratina 14 sobre un corte de cultivo organotípico. A diferencia de la piel, no se observa ningún gradiente de expresión; se sigue expresando en las capas superiores.

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En esta imagen vemos la localización de la keratina 10 en piel normal, cuyo patrón de expresión es aproximadamente inverso al de la keratina 14, es decir, se expresa en las capas suprabasales, las más alejadas de la dermis. [En la página de esta foto en flickr, esta imagen tiene notas al pasar el ratón por encima que pueden ser útiles para entender esta técnica.]

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Aquí la misma tinción para el cultivo organotípico. De nuevo se observa una falta de gradiente. [Ignorar el artefacto: La distancia entre la dermis y la epidermis se debe al procesado de la muestra]

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Aquí vemos la involucrina en piel normal. La involucrina se suele utilizar como un indicador de la diferenciación de la epidermis, ya que sólo se expresa en las capas más superiores.

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En esta imagen vemos la localización de la involucrina en el cultivo organotípico. Su expresión es algo más difusa.

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Conclusiones

La presencia de involucrina en el cultivo organotípico demuestra que existe diferenciación y que ésta se está completando correctamente. Sin embargo, los patrones de expresión de keratina 10 y keratina 14 nos dicen que dicha diferenciación no se está llevando a cabo de la misma forma programada y ordenada que tiene lugar en nuestra piel. Ahora queda dar otra vuelta de tuerca…

Espero que os hayan gustado estos artículos y que los no biólogos no los hayan encontrado demasiado pesados.

Lo que se describe en este artículo es una versión simplificada, y muchos términos técnicos o datos han sido omitidos para aumentar su claridad.