Tras estos resultados, se optó por empezar experimentos con Keratinocitos primarios. Los primeros resultados no fueron nada alentadores: morían todas las células sembradas sobre el gel de colágeno. Se empezó a modificar la composición del medio de cultivo y tras varios intentos (muchos meses de trabajo) finalmente se dio con algo que funcionaba. Al ver el cultivo organotípico al microscopio se vio esto:

Muy cerca

Por fin algo que se acercaba a piel. Las capas basales de la epidermis son un tanto irregulares, pero lo que importa es que los keratinocitos se diferencian y acumulan keratina. Las tres bandas típicas de la foto de libro de texto de la piel al menos se pueden intuir. La siguiente pregunta a hacerse ahora era: ¿Es sólo la estructura lo que se parece o también se parece la función?

Inmunofluorescencia

Para contestar esa pregunta se realizaron diversas inmunofluorescencias sobre cortes de piel normal y cortes de cultivos organotípicos. La Inmunofluorescencia es una técnica de biología molecular que consiste en incubar una muestra con un anticuerpo que detecte la molécula o componente que queramos detectar. Dicho anticuerpo lleva unida una molécula fluorescente (inmunofluorescecnia directa) o bien es reconocido por un segundo anticuerpo marcado fluorescentemente (inmunfluorescencia indirecta).

Las moléculas fluorescentes tienen la particularidad de que emiten luz de una determinada longitud de onda al ser excitadas con luz de otra determinada longitud de onda.

En las siguientes microfotografías se ha utilizado un anticuerpo para detectar la molécula que nos interesaba y luego un anticuerpo secundario que reconoce al primero (técnica indirecta) que estaba unido a “Alexa 488″, una molécula fluorescente que emite luz verde al ser estimulada con luz de una longitud de onda de 488nm. Se ha utilizado también DAPI, una molécula fluorescente que emite en la región del azul cuando está unida a DNA, de forma que nos permite ver la localización de los núcleos de las células.

Resultados

Aquí podemos ver un corte de piel normal incubado con un anticuerpo anti-keratina 14. La keratina 14 es una de las (muchas) variedades de keratina y su particularidad es que se expresa en las capas basales de la epidermis.

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En la imagen superior vemos la misma tinción de keratina 14 sobre un corte de cultivo organotípico. A diferencia de la piel, no se observa ningún gradiente de expresión; se sigue expresando en las capas superiores.

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En esta imagen vemos la localización de la keratina 10 en piel normal, cuyo patrón de expresión es aproximadamente inverso al de la keratina 14, es decir, se expresa en las capas suprabasales, las más alejadas de la dermis. [En la página de esta foto en flickr, esta imagen tiene notas al pasar el ratón por encima que pueden ser útiles para entender esta técnica.]

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Aquí la misma tinción para el cultivo organotípico. De nuevo se observa una falta de gradiente. [Ignorar el artefacto: La distancia entre la dermis y la epidermis se debe al procesado de la muestra]

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Aquí vemos la involucrina en piel normal. La involucrina se suele utilizar como un indicador de la diferenciación de la epidermis, ya que sólo se expresa en las capas más superiores.

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En esta imagen vemos la localización de la involucrina en el cultivo organotípico. Su expresión es algo más difusa.

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Conclusiones

La presencia de involucrina en el cultivo organotípico demuestra que existe diferenciación y que ésta se está completando correctamente. Sin embargo, los patrones de expresión de keratina 10 y keratina 14 nos dicen que dicha diferenciación no se está llevando a cabo de la misma forma programada y ordenada que tiene lugar en nuestra piel. Ahora queda dar otra vuelta de tuerca…

Espero que os hayan gustado estos artículos y que los no biólogos no los hayan encontrado demasiado pesados.

Lo que se describe en este artículo es una versión simplificada, y muchos términos técnicos o datos han sido omitidos para aumentar su claridad.

Mi grupo de investigación se centra en la psoriasis, una enfermedad bastante compleja cuyos mecanismos exactos son poco conocidos, con componentes autoinmunes e inflamatorios (más información en la página sobre la psoriasis en la wikipedia). Mi papel en el grupo es establecer un modelo de equivalente de piel organotípico. Dicho de otra forma, lo que pretendo hacer es coger fibroblastos humanos y keratinocitos y cultivarlos de tal forma que resulte algo parecido a la piel (de ahí lo de organotípico, como un órgano, en este caso, piel). Dicho modelo servirá para que otros miembros del grupo puedan diseñar experimentos para descubrir causas, tratamientos o posibles fármacos.

Debo decir que mi proyecto no es nada revolucionario; este modelo ya ha sido desarrollado por muchos otros grupos, pero en ciencia se trata de coger lo que han hecho otros y darle otra vuelta de tuerca. Y luego, como siempre digo, la ciencia es como la cocina: tener una buena receta no significa necesariamente saber hacer el pastel.

La piel

Un corte de piel teñido y visto al microscopio sería algo parecido a esto (tinción de hematoxilina y eosina):

En la imagen observamos 3 bandas bien diferenciadas. De abajo a arriba, observamos una zona más clara, con pocas manchas oscuras. Se trata de la dermis, y las manchas son los núcleos de los fibroblastos. Sobre esta banda se organizan los keratinocitos, que podemos ver de color fucsia más fuerte. Esta banda está polarizada, lo que quiere decir que las céluas de la parte de arriba y las de abajo no son exactamente iguales. Las inferiores más próximas a la dermis, son células que podríamos llamar “jóvenes” o poco diferenciadas que se multiplican casi constantemente. Según las células se dividen, empujan a las ya existentes hacia el exterior (o hacia arriba). A lo largo de este “ascenso”, van sintetizando cada vez más queratina que acumulan en su citoplasma, hasta que eventualmente pierden el núcleo y se fusionan unas con otras, formando capas de queratina. Estas capas corresponderían a la tercera banda, que en la fotografía se visualiza como hilos. La separación de las capas de keratina exterior de la piel se produce al procesar la muestra (estos fallos debidos a la manipulación se denominan “artefactos”).

Si alguien quiere saber más acerca de la piel, le recomiendo esta página: manual de histología de la piel un recurso muy bueno con muchas fotos muy bien explicadas (en inglés).

Fibroblastos

Los fibroblastos son la célula principal de los tejidos conectivos (también llamados “de sostén” o “blandos”), como es el caso de la dermis, donde su función es la de dar estructura a los tejidos, sintetizando matriz extracelular (o fibras). En esta microfotografía podemos ver fibroblastos humanos cultivados en el laboratorio.

Los fibroblastos los obtenemos de pacientes (y también de donantes sanos) a partir de trocitos de piel. Son células inmortales (básicamente), es decir, dada su escasa diferenciación se pueden seguir dividiendo durante mucho tiempo y son muy fáciles de cultivar in vitro (del latín “en vidrio”, aunque ahora casi todo lo que usamos es de plástico, jeje).

Keratinocitos

Aunque en castellano su nombre correcto sea probablemente queratinocitos (dado que en castellano lo correcto sería decir queratina), debido al uso del inglés como lenguaje científico me tomo esa licencia. Esta es una microfotografía de keratinocitos humanos (o HuKs) en cultivo.

La función de los keratinocitos, como su propio nombre indica, es sintetizar keratina, que es el componente mayoritario de la piel tal y como la vemos nosotros (desde fuera ). En cultivos artificiales crecen como una monocapa, pero in vivo crecen formando lo que se llama un epitelio estratificado (muchas capas), como ya hemos podido ver en la microfotografía de la piel. La dificultad de cultivarlos estriba en que sólo se dividen un número determinado de veces, ya que tienden a diferenciarse (acumular keratina). Al igual que los fibroblastos, se obtienen también de trocitos de piel.

En el laboratorio aveces utilizamos células HaCaT, que son unos keratinocitos que por mutación espontánea han perdido la capacidad de diferenciarse, lo que los convierte en una línea inmortal (que se divide indefinidamente). Los utilizamos porque es más fácil cultivarlos y no dependemos de un paciente para obtenerlos.

Equivalentes dérmicos de co-cultivos organotípicos

El objetivo es conseguir algo lo más parecido posible a piel a partir de las células que la componen. Para ello necesitamos una cantidad suficiente de fibroblastos y keratinocitos. Los fibroblastos se mezclan con colágeno (una especie de gelatina que es uno de los componentes de la dermis) y la mezcla se pone sobre una membrana de nylon. Una vez que el gel solidifica, encima de él se siembran los keratinocitos (o células HaCaT, según el caso).

En el esquema podéis ver a qué se parece todo en la práctica. La membrana de nylon es la base de un “cacito” que se inserta en un pocillo de una placa de plástico. Podéis observar el gel, con los fibroblastos entremedias y los keratinocitos encima. En el pocillo se pone medio de cultivo, que contiene los nutrientes necesarios para que las células crezcan y que penetra desde abajo debido a los poros que tiene la membrana de nylon. Así el modelo se parece a la piel, en la que los nutrientes llegan desde las capas más profundas.

Tras unos 12 días, el gel se recoge, se procesa y se tiñe. Después se mira al microscopio. Una de las primeras imágenes que obtuve fue esta:

A estas alturas de mi trabajo, aún no se parecía demasiado a piel, básicamente porque las HaCaT no son capaces de diferenciarse (a pesar de intentar animarlas con un montón de drogas).

ACTUALIZACIÓN (10-Nov-08): Ya está publicada la segunda parte de este artículo.

Lo que se describe en este artículo es una versión simplificada, y muchos términos técnicos o datos han sido omitidos para aumentar su claridad.